单细胞测序分析【1】---样本的基础处理

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我是靠谱客的博主花痴钢笔，最近开发中收集的这篇文章主要介绍单细胞测序分析【1】---样本的基础处理，觉得挺不错的，现在分享给大家，希望可以做个参考。

概述

（1）细胞样本名字的标准化

细胞名字要求：“样本号” + “-” + “细胞号”

例：

注：上面的是原来的名字，我们要保留subject和cell，前面的SCRNA和TEMRA不要

library(stringr)
head(colnames(d1))
Name <- colnames(d1)
Name_1 <- str_replace(Name, "SCRNA_", "")
Name_2 <- str_replace(Name_1, "TEMRA_", "")
head(Name_2)
colnames(d1) <- Name_2

注：用 str.replace将两个多余的部分去掉

（2）基因名字是ENSYMBL还是symbool

例：

注：上面的基因名字不是symbol，而是带版本号的ENSYMBL，需要去版本号，然后转化

d1 <- File
library(stringr)
d1$id <- unlist(str_split(d1$id,"[.]",simplify=T))[,1]
d1[,1][1:5]

注：上面这是去掉版本号

library(limma)#avereps所在的函数包
data <- d1


#将基因ENSEMBL转化为geneSymbol
library(AnnotationDbi)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)

keytypes(org.Hs.eg.db)
gene.ens.id <- data[,1]
genes <- AnnotationDbi::select( org.Hs.eg.db, keytype = "ENSEMBL", keys =  gene.ens.id, columns = c("SYMBOL"))

name_data <- data[,1]
name_data_gai <- genes[match(name_data, genes$ENSEMBL),]

data <- as.matrix(data)
rownames(data) <- name_data_gai[,2]
exp <- data[,2:ncol(data)]
dimnames <- list(rownames(exp),colnames(exp))
data <- matrix(as.numeric(as.matrix(exp)),nrow=nrow(exp),dimnames=dimnames)
data <- avereps(data)


#因为在这里很容易出现空白名字，所以，得去掉，不是空白名字，而是名字NA，有一个
data <- data[-match(NA,rownames(data)),]

注：这就将名字改过来了

注：但注意：线粒体基因没有MT-开头，所以在之后的计算线粒体基因活性的步骤中，这一步将被过滤，当然，其实对实验的影响很小，如果之后有更好的方法来替换gene id又能保留MT-，将更新。

（3）细胞线粒体基因前面是MT还是MT-还是说啥前缀也没有，还有一点，老鼠是mt-

mito_genes  <- rownames(testdf)[grep("^MT-", rownames(testdf))] 
mito_genes #线粒体基因

注：这个代码是用来检测线粒体基因的开头是啥的，又是后要注意，有些情况下，作者的线粒体基因以MT开头，在后面同样不能筛选线粒体基因，为啥呢？因为还有很多无辜的基因会被你一同算进去。这里的testdf是一开始输入的原始数据。如果基因名字不是行名而是第一列，请更改代码：rownames(testdf) 为 testdf[,1]

注意：有些是MT_，坑得很

（4）细胞到底是 counts 还是标准化以后的数据

（1）按照正常流程录入的初始数据因该是原始counts数据，它会存在test.seu@count中；然后对原始数据进行筛选，将及其不活跃的细胞和及其不活跃的细胞，还有线粒体基因表达过于高的细胞踢掉；之后在进行独有的标准化：每细胞基因的计数除以总计数，再乘以scale.factor，最后再log(n+1)，其scale.factor是人为设置，一般是10000，这一步的作用是消除每一个细胞的测序深度

（2）如果线粒体基因不是以MT-开头，则，不能删除线粒体基因极度高表达的细胞

（3）如果是标准化以后数据，一般是TPM和FKTM，它已经经过缩聚处理，只需要再log就行，pbmc@data = log(TPM + 1)

### 常规流程
test.seu=CreateSeuratObject(counts = testdf)
test.seu <- NormalizeData(test.seu, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
test.seu <- FindVariableFeatures(test.seu, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
......

### TPM数据
test.seu1=CreateSeuratObject(counts = log(mat_tpm+1))
test.seu1 <- FindVariableFeatures(test.seu1, selection.method = "mvp", nfeatures = 2000)

# 或者
test.seu=CreateSeuratObject(counts = mat_tpm)
test.seu[["RNA"]]@data=as(as.matrix(log(mat_tpm + 1)), "dgCMatrix")
test.seu <- FindVariableFeatures(test.seu, selection.method = "mvp", nfeatures = 2000)

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