seurat提取表达矩阵_Seurat教程 || 分析Cell Hashing数据

分享是一种态度

作者 |  周运来

男，

一个长大了才会遇到的帅哥，

稳健，潇洒，大方，靠谱。

一段生信缘，一棵技能树，

一枚大型测序工厂的螺丝钉，

一个随机森林中提灯觅食的津门旅客。

Cell Hashing是与NYGC的技术创新小组合作开发的，它使用低聚标记(oligo-tagged)抗体来标记表面蛋白，在每个单细胞上放置一个“样本条形码(sample barcode)”，使得不同的样本可以被多路复用并在单个实验中运行。更多信息，可以参阅Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics。(https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1603-1)

其实我们在去年十月份的时候就关注过这个技术：Cell Hashing||单细胞多模态分析(https://www.jianshu.com/p/6ae3cc09d335)。案牍劳形，一直也没有再写它的文章了。今天我们依然跟着Seurat的官网来看看这个是如何分析的。请注意，如果需要看教程，请看官网。一则受个人的能力所限，一则官网才是更新快和及时的。

这里将简要演示如何在Seurat中处理由Cell Hashing 生成的数据。应用于两个数据集，我们可以成功地将细胞分离到它们的原始样本，并识别出交叉样本双峰(cross-sample doublets)。

多路复用函数HTODemux()实现了以下过程:

• 我们对标准化的HTO值执行K -medoid聚类，它最初将细胞分离为K(# of samples )+1聚类。
• 我们计算了HTO的一个“负”分布。对于每个HTO，我们使用平均值最低的群作为背景组。
• 对于每个HTO，我们对负的聚类拟合一个负的二项分布。我们使用这个分布的0.99分位数作为阈值。
• 根据这些阈值，每个细胞被划分为阳性或阴性的HTO。
• 对于一个以上hto呈阳性的细胞被标注为双峰。

数据集描述

• 数据代来自个不同献血者的外周血单核细胞(PBMCs)。
• 每个供体的细胞都使用CD45作为哈希抗体进行唯一标记。
• 随后在10X Chromium v2系统的单一lane上运行。
• 你可以在这里(https://www.dropbox.com/sh/ntc33ium7cg1za1/AAD_8XIDmu4F7lJ-5sp-rGFYa?dl=0)下载RNA和HTO的计数矩阵，或者从GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE108313)下载FASTQ文件

原教程用的是他们处理好的rds文件，而这个我并没有成功下载，就从GEO中下载了表达谱，自己来构建Seurat的对象，所以会有所不同。这里要注意HTO数据一般和RNA的数据是对应的，对于RNA的我们很熟悉了，但是HTO的数据可能并不熟悉，这就要求我们看看 CITE-seq-Count(https://github.com/Hoohm/CITE-seq-Count) 的数据处理过程及其输出格式。

CITE-Seq 一般的序列结构：

For CITE-seq-Count, the output looks like this:

OUTFOLDER/
-- umi_count/
-- -- matrix.mtx.gz
-- -- features.tsv.gz
-- -- barcodes.tsv.gz
-- read_count/
-- -- matrix.mtx.gz
-- -- features.tsv.gz
-- -- barcodes.tsv.gz
-- unmapped.csv
-- run_report.yaml

好了我们了解了这个格式其实和10X的基本是一致的，这样我们就不用担心了，先读hto数据来看看。请注意，我们下载的是表达谱。

library(Seurat)
library(readr)

hto"GSM2895283_Hashtag-HTO-count.csv.gz")
Parsed with column specification:
cols(
  .default = col_double(),
  X1 = col_character()
)
See spec(...) for full column specifications.
|=================================================================| 100%    2 MB

hto[1:4,1:4]
# A tibble: 4 x 4
  X1                  GGCGACTAGAGGACGG CATCAAGGTCTTGTCC AAACCTGAGTGATCGG
                                                    
1 BatchA-AGGACCATCCAA               30                4               12
2 BatchB-ACATGTTACCGT               16               39               15
3 BatchC-AGCTTACTATCC               26                0               19
4 BatchD-TCGATAATGCGA             2698               22                2
> yhto 
rownames(yhto) # 整理行名
yhto[1:4,1:4]
                    GGCGACTAGAGGACGG CATCAAGGTCTTGTCC AAACCTGAGTGATCGG
BatchA-AGGACCATCCAA               30                4               12
BatchB-ACATGTTACCGT               16               39               15
BatchC-AGCTTACTATCC               26                0               19
BatchD-TCGATAATGCGA             2698               22                2
                    TGAGGGAGTACTTAGC
BatchA-AGGACCATCCAA               26
BatchB-ACATGTTACCGT               20
BatchC-AGCTTACTATCC               13
BatchD-TCGATAATGCGA               24
rownames(yhto)# BatchA-AGGACCATCCAA，BatchB-ACATGTTACCGT，BatchC-AGCTTACTATCC，#  BatchD-TCGATAATGCGA，BatchE-GAGGCTGAGCTA，BatchF-GTGTGACGTATT，#  BatchG-ACTGTCTAACGG，BatchH-TATCACATCGGT# 还有特殊的三行：# bad_struct;no_match;total_reads